Efectos de la suplementación alimentaria con glucosa oxidasa sobre el rendimiento, digestibilidad aparente de aminoácidos ileales y microbiota ileal de pollos broiler

La glucosa oxidasase usó como un aditivo potencial para mejorar la salud intestinal en ganadería y avicultura. Este estudio buscó investigar los efectos de la suplementación con glucosa oxidasa sobre el rendimiento, la microbiota ileal, el perfil ileal de ácidos grasos de cadena corta y la digestibilidad ileal aparente en pollos de engorde. Nuestros resultados proporcionarán una valiosa perspectiva sobre la posibilidad de utilizar la glucosa oxidasa como alternativa a los antibióticos promotores de crecimiento en las dietas de pollos de engorde. 

Resumen

El objetivo de este estudio fue investigar los efectos de la suplementación con glucosa oxidasa (GOD) sobre el rendimiento de crecimiento, la digestibilidad ileal aparente (DIA) de los nutrientes, la morfología intestinal, los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) y la microbiota en el íleon de los pollos de engorde. Se distribuyeron 600 pollos de engorde machos de un día de edad de manera aleatoria en cuatro grupos de 10 réplicas cada uno, con 15 aves por jaula de réplica. Los cuatro tratamientos incluían la dieta basal sin antibióticos (Control) y la dieta basal suplementada con 250, 500 o 1000 U GOD/kg (E250, E500 o E1000). Se recogieron muestras de los diferentes segmentos intestinales, mucosa ileal y digesta ileal en el día 42. La suplementación con GOD no afectó la ganancia diaria de peso corporal (GDPC) ni la relación entre el consumo de pienso y la ganancia de peso corporal (TCA) durante los días 1 a 21 (p > 0,05); sin embargo, el tratamiento con E250 incrementó la GDPC (p = 0,03) durante los días 22 a 42 en comparación con el grupo control. La suplementación con GOD incrementó la DIA de arginina, isoleucina, lisina, metionina, treonina, cisteína, serina y tirosina (p < 0,05). No se observó diferencias significativas entre los grupos que recibieron GOD.  El tratamiento con E250 incrementó la altura de las vellosidades tanto del yeyuno como del íleon. Las concentraciones de inmunoglobulina A secretada (sIgA) en la mucosa ileal y los contenidos de ácido acético y ácido butírico en la digesta ileal fueron mayores en el grupo E250 que en el grupo control (p < 0,05) y no se observaron diferencias significativas en los grupos E500, E1000 y control. El tratamiento con E250 aumentó la riqueza de la microbiota ileal, pero los tratamientos con E500 y E1000 no tuvieron un efecto significativo. El tratamiento con E250 aumentó la abundancia relativa del filum Firmicutes y del género Lactobacillus; y, por otro lado, disminuyó la abundancia relativa del género Escherichia-Shigella (p < 0,05). El filum Fusobacteria solo colonizó la digesta ileal de los pollos tratados con E500. El tratamiento con E500 y E1000 no afectó la abundancia relativa del filum Firmicutes y los géneros Lactobacillus y Escherichia-Shigella en comparación con el grupo control. Estos resultados sugieren que la suplementación con 250 U GOD/kg de dieta mejora el rendimiento de crecimiento de pollos de engorde durante los días 22 a 42, lo cual podría estar relacionado con la alteración de la morfología intestinal, la composición de los AGCC y la composición de la microbiota intestinal. 

Palabras clave: glucosa oxidasa, rendimiento de crecimiento, digestibilidad de aminoácidos, microbiota ileal, pollos de engorde

Introducción

La producción animal libre de antibióticos ha recibido mucha atención en los últimos años debido a que muchos países han aumentado la regulación en torno al uso de antibióticos promotores de crecimiento en la formulación de piensos. La dieta libre de antibióticos incrementa los casos de enfermedades intestinales y disminuye el rendimiento de crecimiento de los pollos de engorde [1,2]. Estudios recientes han mostrado que la glucosa oxidasa (GOD) es un aditivo potencial para mejorar la salud intestinal y el rendimiento de los pollos de engorde [3]. La inclusión de dosis bajas de GOD (40-60 U/kg) en la dieta mejora la ganancia de peso corporal y la eficiencia alimentaria de los lechones destetados [4-6]. Sin embargo, hubo resultados inconsistentes en el efecto de la inclusión de GOD sobre el rendimiento de crecimiento en aves de corral. Wu et al. descubrieron que la inclusión de dosis bajas de GOD (40 – 60 U/kg) en la dieta aumentó el rendimiento de crecimiento durante los días 1 a 21, y por otro lado no aumentó significativamente el rendimiento de crecimiento del día 22 a 42 en pollos de engorde de crecimiento rápido [7]. La inclusión de dosis bajas de GOD tampoco incrementó significativamente el rendimiento de crecimiento en pollos de engorde de crecimiento lento entre los días 1 y 52 [8] y en patos entre los días 10 y 28 [9]. La inconsistencia en estos resultados podría atribuirse a las diferencias en las dosis de GOD, el periodo de crecimiento, la cepa de pollos de engorde y las especies de aves de corral. Recientemente, los avances en la tecnología en la producción de GOD ha logrado incrementar la actividad de la GOD por unidad de peso de los productos, lo que ha hecho posible incluir dosis relativamente altas de GOD en las dietas animales. Sin embargo, se han llevado a cabo pocas investigaciones sobre los efectos de dosis altas de GOD sobre el rendimiento de crecimiento de aves de corral. 

La microbiota intestinal desempeña un importante papel en la digestibilidad de los nutrientes en el intestino de los pollos de engorde [10,11]. Wu et al. observaron que la inclusión de Lactobacillus en la dieta alteró la composición de la microflora a nivel del íleon y el ciego de los pollos de engorde, lo cual aumentó la digestibilidad de energía, los aminoácidos y el calcio [12]. Rodjan en at. también reportaron que la inclusión de Bacillus en la dieta aumentó la digestibilidad de la fibra cruda en pollos de engorde [13]. Por otro lado, la microbiota intestinal también puede alterar la producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) procedentes de la fermentación de nutrientes no digeribles, lo cual afecta la integridad de la barrera epitelial y las funciones inmunorreguladoras [14]. Además, la microbiota intestinal es uno de los principales componentes de defensa en el intestino de pollo contra las bacterias patógenas del intestino, particularmente Clostridium perfringens [15,16]. Estudios anteriores informaron que la GOD inhibe el crecimiento de patógenos trasmitido por medio de los alimentos, como Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni y Salmonella infantis [17, 18]. También se observó que sus productos, ácido glucónico y peróxido de hidrógeno, tienen capacidad antimicrobiana contra Paenibacillus larvae ATCC9545 [19]. La inclusión de GOD en la dieta aumentó la abundancia relativa de bacterias cecales beneficiosas en los pollos de engorde en etapa de inicio, tales como Firmicutes y Ruminococcaceae [7], y mejoró la función inmunitaria de los patos frente a Escherichia coli O88 [8]. Sin embargo, se han conducido pocos estudios sobre los efectos de la inclusión de la GOD en la dieta sobre la microbiota ileal de las aves de corral. Nuestra hipótesis fue que la dosis alta de GOD afectaría la microbiota ileal y la digestibilidad de los nutrientes, lo cual a su vez mejoraría la calidad de los pollos de engorde (día 22 a 42). Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar los efectos de la inclusión de dosis altas de GOD (por encima de 250 U/g) sobre el rendimiento, la digestibilidad de amino ácidos ileales, la concentración de AGCC, y la microbiota ileal en pollos de engorde. 

Materiales y métodos

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Sichuan (código ético: 2018-21) y se realizaron siguiendo las directrices establecidas por el Instituto Nacional de Salud Animal de manera estricta.

• Animales y dietas

Se asignaron 600 pollos machos de 1 día de edad de forma aleatoria (cepa Arbor Acres) a 1 de 40 jaulas de alambre suspendidas, de modo que cada jaula contenía 15 pollos. Los tratamientos dietéticos incluyeron la dieta basal (Control) y la dieta basal con una inclusión de 250, 500 o 1000 UI de GOD/kg de dieta (E250, E500 o E1000), que correspondían a la dieta basal con una inclusión de 0, 50, 100 o 200 mg de producto GOD/kg de dieta (5000 UI/g de producto GOD). Mianyang Habio Bioengineering Co., Ltd (Mianyang, China) suministró la GOD y se analizó su actividad antes de incluirla en la dieta. Las unidades experimentales (jaulas) se distribuyeron aleatoriamente en los 4 tratamientos dietéticos, con 10 réplicas por tratamiento. Las dietas basales (Tabla 1) se formularon para satisfacer o superar los requerimientos de nutrientes recomendados por el Estándar de Alimentación de Pollos [20]. Todas las dietas fueron sometidas a peletizado en frío (60 a 65°C). 

• Gestión de los animales

El experimento se llevó a cabo en la granja del Instituto nacional de Nutrición Animal de la Universidad Agrícola de Sichuan, China. Todas las aves fueron criadas en jaulas suspendidas (100 X 200 X 45 cm) en un galpón de ambiente controlado. La temperatura se mantuvo a 32°C durante los primeros dos días. Después, la temperatura ambiente se redujo gradualmente 1°C cada dos días hasta alcanzar los 22°C y se mantuvo a este nivel hasta el final del experimento. Todas las aves se alojaron bajo un ciclo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad y recibieron pienso y agua ad libitum. La humedad relativa del galpón se mantuvo al 50%.

• Rendimiento de crecimiento y características del canal

En los días 21 a 42, se pesaron los pollos y el pienso no consumido de cada réplica para determinar el consumo de pienso y la ganancia de peso corporal y poder calcular la ganancia diaria de peso corporal (GDPC), la ingesta diaria de alimento (IDA) y la relación entre consumo de pienso y ganancia de peso corporal durante los plazos de 1 a 21 días, 22 a 42 días y a 1 a 42 días. Se controló a diario el número de pollos y se registró el número y el peso de los pollos muertos y eliminados. Se calculó la mortalidad durante los días 1 a 42. En el día 42, se seleccionó un ave por réplica, cuyo peso corporal se aproximaba al peso corporal promedio de la réplica. Todas las aves seleccionadas fueron sometidas a eutanasia usando CO₂.  Tras desangrarlas, se les extrajo la cabeza, plumas, patas, órganos digestivos, grasa abdominal (la grasa que rodea los órganos abdominales) y los órganos internos (corazón, hígado, bazo, bursa y pulmón). A continuación, se lavó la canal por aspersión, se enfrió por inmersión a 2°C durante 30 min y se escurrió eficazmente durante 5 minutos. El rendimiento de la canal se calculó como porcentaje de peso vivo. El músculo de la pata, el músculo de la pechuga y la grasa abdominal se pesaron y se presentaron como porcentaje de peso corporal vivo.  

• Recolección de muestras

En el día 42, se seleccionaron tres aves por réplica al azar para ser sometidas a eutanasia con CO₂. Tras desangrarlas, se recogieron los segmentos medios (aproximadamente 1 cm.) de duodeno, yeyuno e íleon de un ave por réplica y se fijaron en solución de paraformaldehído al 10% para realizar los análisis morfológicos intestinales. Los segmentos duodenales, yeyunales o ileales restantes se utilizaron para recoger muestras de mucosa para el análisis de inmunoglobulina A secretada (sIgA). Se recogió la digesta del duodeno, yeyuno e íleon para determinar el valor del pH. En otras dos aves, el contenido del íleon se recogió asépticamente, se mezcló con una muestra y se almacenó a -20°C hasta realizar los análisis de AGCC y microbiota ileal. 

• Probabilidad de digestibilidad ileal aparente de nutrientes

Durante los días 36 a 42, todas las aves fueron alimentadas con las dietas con una inclusión de 0,3 % de Cr₂O₃ como marcador inerte. Designamos una semana de alimentación preliminar para que los pollos de engorde se adaptaran a la dieta que contenía el Cr₂O_3. En el día 42, se seleccionaron 4 aves por réplica de manera aleatoria a las cuales se les aplicó la eutanasia mediante inyección intravenosa de pentobarbital sódico (80 mg/kg de peso corporal; Sigma-Aldrich, Shanghái, China). A continuación, se abrieron las cavidades abdominales de las aves de inmediato y se extirpó el segmento medio del íleon desde el divertículo de Meckel hasta 2 cm proximales a la unión íleo-cecal. La digesta en la mitad distal del íleon se recogió enjuagando suavemente con agua destilada en un recipiente de plástico. El contenido ileal de las aves de cada réplica se reunió en una sola muestra. Todas las muestras de digesta se congelaron -20°C inmediatamente después de su recolección hasta su análisis. 

• Analisis químicos

Todas las muestras de digesta se liofilizaron a -50°C (FDU-2110, EYELA, Tokio, Japón). Antes de los análisis, las dietas y las muestras de digesta deshidratada se trituraron en un molino analítico hasta que se hicieron pasar por un tamiz de 0,18 mm. Las dietas y las muestras de digesta se analizaron para determinar la energía bruta, la proteína bruta y los aminoácidos en base a la materia seca (MS). La MS se determinó secando a 105°C durante 24 h (método 934.01; AOAC, 2005). Se determinó la energía bruta utilizando un calorímetro de bomba (Parr Instrument Co., Moline, IL, EEUU.). La concentración de energía bruta se midió según el método de la AOAC (método 990.3; AOAC, 2005). Las concentraciones de aminoácidos se determinaron utilizando un analizador de aminoácidos (L-8900, Hitachi, Tokio, Japón). En resumen, se hidrolizaron 0,2 g de muestra con HCL 6 N con un contenido de 6 g/L de fenol durante 24 h a 110°C en un tubo de vidrio sellado al vacío. Para los análisis de cisteína y metionina, las muestras se oxidaron con ácido perfórmico durante 16 h a 0°C, y después se dio fin a la reacción añadiendo ácido bromhídrico antes de la hidrólisis ácida. La concentración de cromo se determinó por medio de la digestión de las muestras en ácido nítrico concentrado y ácido perclórico, y la absorción se midió utilizando un espectrofotómetro a 440 nm (Beckman DU-800; Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, EEUU.). Todos los análisis se realizaron por duplicado. 

• Morfología intestinal, inmunoglobulina A secretada y pH de la digesta intestinal

Los segmentos de duodeno, yeyuno e íleon fijados en paraformaldehído se deshidrataron en series graduadas de alcohol y se embebieron en parafina. A continuación, se seccionaron los bloques de parafina en láminas de 5 μm utilizando un micrótomo, se colocaron en una lámina portaobjetos de vidrio y se tiñeron con hematoxilina y eosina para su posterior revisión microscópica. La evaluación morfológica incluyó la altura de las vellosidades (VH; la distancia desde el ápice de la vellosidad hasta la unión de la vellosidad y la cripta) y la profundidad de la cripta (CD; la distancia desde la unión a la membrana basal de las células epiteliales en el fondo de la cripta). Después, se calculó la relación entre la altura de las vellosidades y la profundidad de la cripta (VH/CD) para cada grupo de tratamiento. La concentración de inmunoglobulina A secretada (sIgA) en las muestras de mucosa duodenal, yeyunal e ileal se determinó mediante el uso de kits de ELISA (Nanjing Jiancheng Biological Engineering Research Institute, Nanjing, China). Se midió el pH de la digesta duodenal, yeyunal e ileal en muestras frescas según lo descrito por Yang et al. [21]. En resumen, se diluyó un gramo de digesta fresca en 9 ml de agua desionizada y luego se determinó el pH de la digesta utilizando el medidor de pH (HI2210, Hanna Instruments, Inc., Woonsocket, RI, EEUU.). 

• Análisis de ácidos grasos de cadena corta (AGCC)

Se determinaron las concentraciones de ácido acético, propiónico, butírico, valérico e isovalérico en la digesta ileal mediante cromatografía de gases según lo descrito por Bassanini et al. [22]. Todos los análisis se realizaron utilizando un cromatógrafo de gases (GC-CP3800, Varian, Walnut Creek, CA, EEUU) equipado con un detector de ionización de llama y una columna cromatográfica (30 m x 0,245 mm de diámetro interior, 0,25 μmde espesor de película; Agilent, Santa Clara, CA, EEUU.). Brevemente, se suspendieron aproximadamente 0,7 g de digesta ileal en 1,5 mL de agua destilada. Luego, la solución mezclada se centrifugó por 15 minutos a 15 000 g. Se transfirió 1 mL del sobrenadante homogéneo a un microtubo cónico de polipropileno (Eppendorf, 2mL) y luego se agregó 0,2 mL de ácido metafosfórico (25 %, p/v) y 23,3 μL de ácido crotónico (210mml/L). Se añadieron 10 μL de una solución de 150 mmol/L de 2- ácido etilbutírico en ácido fórmico como patrón interno. Después, la solución mezclada se cultivó durante 30 min a 4°C y luego se centrifugó durante 10 min a 15 000 g. Se transfirieron los 0,3 mL de sobrenadante a un tubo Eppendorf y se añadieron 0,9 mL de ácido fórmico. Tras la centrifugación (5 min a 10 000 g), se inyectó 1 μL de sobrenadante en el cromatógrafo de gases para su análisis. Los resultados se expresan en nmol/g o pmol/g de peso húmedo de la digesta. 

• Extracción de ADN, amplificación por PCR y secuenciación

Se extrajo el ADN de seis de las diez muestras de contenido ileal utilizando el kit de extracción MiniBEST Bacteria DNA Extraction Kit (TaKaRa Bio Inc., Dalian, China). Se purificó el ADN extraído usando el kit Zymbiomics DNA Microprep (Cat# D4301; Zymo Research, Irvine, CA, EEUU.). Luego, se midió la concentración de ADN utilizando el Tecan infinite® 200 (Männedorf, Suiza) y se evaluó la calidad de ADN mediante electroforesis en gel. Se amplificó la región variable V4 del gen 16S rRNA a partir de ADN extraído utilizando los cebadores con código de barras 5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA‐3′ (directo) y 55‐GGAC‐ TACHVGGGTWTCTAAT‐3AT‐3′ (indirecto). La reacción de PCR se realizó utilizando un volumen de 50 μL de premezcla que contenía 0.5 μL de polimerasa KOD‐Plus‐Neo (1U/50 μL; TOYOBO Co., Ltd., Osaka, Japón), 5 μL de 10 × tampón PCR, 1,5 μL de cebador directo (10 μM), 1,5 μL de cebador indirecto (10 μM), 2 μL de muestra de ADN (20 ng/μL), y 39.5 μL de H2O. El programa de amplificación de PCR incluyó 94 °C por 1 min; luego, 30 ciclos de 95 °C por 20 segundos; 54 °C por 30 segundos; 72 °C por 30 segundos, y una extensión final a 72 °C por 5 min en un termociclador Applied Biosystems® PCR System 9700 (Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA, EEUU.). El producto de la PRC se corrió en un gel de agarosa al 2%, y se recogieron y purificaron las bandas del tamaño deseado utilizando el kit de recuperación de gel Zymoclean (D4008; Zymo Research, Irvine, CA, EEUU). Se midió la concentración de ADN purificado utilizando un fluorómetro Qubit® 2.0 (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, EEUU.). Se armaron las bibliotecas de secuenciamiento de ADN utilizando el kit TruSeq DNA PCR‐Free Sample Prep kit (Illumina Inc., San Diego, CA, EEUU). Se secuenció la biblioteca en la plataforma Illumina MiSeq utilizando el kit Hiseq Rapid SBS kit v2 (Illumina Inc., San Diego, CA, EEUU.).

• Proceso de datos del secuenciamiento y agrupación de unidades taxonómicas operativas (OTU)

Las lecturas de extremos emparejados se ensamblaron con el software FLASH, con una tasa máxima de desajuste del 20 % [23]. Los datos del secuenciamiento se filtraron utilizando el software QIIME [24], y todas las secuencias mostraban: 1) ninguna discordancia con el código de barras, 2) cebador del gen 16S rRNA en el extremo de secuenciamiento, 3) más de 200 nucleótidos de longitud, y 4) no más de dos bases no determinadas. Las secuencias se compararon con la base de datos de referencia (base de datos Silva, https://www.arbsilva.de/) [25] utilizando el algoritmo UCHIME [26] para detectar y eliminar secuencias quiméricas [27]. Las secuencias restantes se agruparon para generar unidades taxonómicas operacionales (OTU) utilizando el software Usearch (v. 7.1) con el algoritmo UPARSE con un límite de similitud del 97 % [28]. La secuencia representativa se anotó utilizando el método UCLUST y la biblioteca se referencia Siliva [29].

• Análisis bioinformáticos

Todos los análisis de datos del microbioma fueron realizados utilizando el software R 3.6.0. Las OTU e índices de diversidad alfa observados, tales como los índices Chao1, ACE, Simpson y Shannon fueron calculados usando el paquete vegen. La comparación de estos índices se realizó mediante el ANOVA de rangos con la prueba no paramétrica de rangos Kruskal-Wallis. Las distancias UniFrac ponderadas y no ponderadas se calcularon con el paquete gunifrac. El análisis de coordenadas principales (PCoA) utilizando las distancias UniFrac ponderadas y no ponderadas se calculó utilizando el paquete ape. Además, se realizó un MANOVA permutacional utilizando el paquete vegan para medir el tamaño del efecto y la significancia sobre la diversidad beta. Se llevó a cabo la comparación taxonómica bacteriana del íleon a nivel de filum y género entre los diferentes tratamientos mediante la prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis. 

• Cálculos y análisis estadísticos

Se calculó la digestibilidad ileal aparente (DIA) de la energía, proteína cruda y aminoácidos mediante la siguiente ecuación: 

DIA (%) = [1 – (CR_dieta / Cr_digesta) x (N_digesta / N_dieta)] x 100

Donde DIA es la digestibilidad ileal aparente del nutriente o de la energía (%), CR_dieta es la concentración de cromo en la dieta, Cr_digesta  es la concentración de cromo en la digesta, N_digesta es la concentración de nutrientes en la digesta y Cr_dieta es la concentración de nutrientes en la dieta. 

Los datos experimentales se analizaron estadísticamente mediante el procedimiento GLM de SAS 9.2. Se utilizó una jaula de réplica como unidad experimental para analizar los datos de rendimiento, digestibilidad de nutrientes, AGCC y microbiota ileales; por otro lado, cada ave seleccionada se utilizó como unidad estadística para analizar los datos de morfología intestinal, sIgA y pH de la digesta intestinal. Los datos se expresaron mediante medias de mínimos cuadrados y errores estándar agrupados. Las medias se separaron utilizando la prueba de Tukey y se consideró una diferencia significativa cuando p < 0.05.

Resultados

• Rendimiento de crecimiento y características de la canal

La Tabla 2 muestra el efecto de la inclusión de GOD en la dieta sobre el rendimiento de pollos de engorde. En comparación con el control, la suplementación con GOD no afectó significativamente el peso corporal de los pollos de engorde a los 21 días de edad ni a Ganancia Diaria de Peso Corporal (GDPC), la ingesta diaria de alimento (IDA) y la tasa de conversión alimenticia (TCA) durante los días 1 a 21 (p > 0.15). Sin embargo, durante los días 22 a 42 la GDPC fue mayor (p = 0.03) en el tratamiento con E250 que en el control y no se observaron diferencias significativas entre los grupos control, E500 y E1000. Durante todo el periodo (días 1 a 42), la suplementación con GOD no influyó significativamente en la GDPC, IDA, TCA ni mortalidad (p > 0.23). En cuanto a las características de la canal de los pollos de engorde, se observó que la inclusión de GOD en la dieta no afectó significativamente el rendimiento de la canal, el rendimiento de la canal eviscerada, el rendimiento del muslo, el rendimiento de la pechuga y el peso de la grasa abdominal (Tabla S1). 

• Digestibilidad ileal aparente de los nutrientes

La Tabla 3 muestra los efectos de la inclusión de GOD en la dieta sobre la digestibilidad ileal aparente (DIA) de los nutrientes. La suplementación dietética con GOD no afectó significativamente las DIA de la materia seca, energía y proteína cruda en comparación con el control (p > 0.07). Sin embargo, aumentaron las DIA de arginina, isoleucina, lisina, metionina, treonina, cisteína, serina y tirosina (p > 0.05) en comparación con el control, independientemente del nivel de GOD incluido. La inclusión de GOD a la dieta no afectó significativamente las DIA de histidina, leucina, fenilalanina, valina, alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina y prolina. 

• Morfología intestinal e inmunoglobulina A secretada (sIgA)

La Tabla 4 muestra los efectos de la inclusión de GOD en la dieta sobre los parámetros morfológicos intestinales y la concentración de sIgA en la mucosa intestinal. No se observaron diferencias significativas en la altura de las vellosidades (VH), la profundidad de la cripta (CD) y la relación VH:CD en el duodeno de pollos de engorde de 42 días de edad entre todos los tratamientos (p > 0.37). El tratamiento con E250 aumentó la VH (p = 0.0042), pero no tuvo ningún efecto significativo sobre la CD y la relación VH:CD en el yeyuno de pollos de engorde en comparación con otros tratamientos. No se observaron diferencias significativas en la CH y la relación VH:CD del yeyuno entre los distintos tratamientos. En el íleon, los tratamientos con E250 y E500 aumentaron la VH (p = 0.001), pero no afectaron la CD ni la relación VH:CD en comparación con el control. No se observaron diferencias significativas entre los grupos control y E1000 en términos de la VH, CD y la relación VH:CD en el íleon de pollos de engorde. El tratamiento con E250 aumentó la concentración de sIgA en el íleon en comparación con los grupos control y E500. Sin embargo, la inclusión de GOD en la dieta no afectó la concentración de sIgA significativamente en la mucosa duodenal y yeyunal de pollos de engorde. 

Tabla 4. Efecto de la inclusión de glucosa oxidasa sobre la morfología intestinal de pollos de engorde a los 42 días de edad. 

• El valor de pH del contenido intestinal

La Tabla 5 muestra el efecto de la inclusión de GOD en la dieta sobre el pH de la digesta intestinal. No se observaron diferencias significativas en el pH de la digesta duodenal entre todos los tratamientos (p = 0,40). Sin embargo, el tratamiento con E500 redujo el pH de la digesta yeyunal en comparación con los demás grupos (p <0,05). El pH de la digesta ileal fue menor (p <0,04) en los tratamientos con E250 y E1000 que en los grupos control y E500. 

• Concentración de ácidos grasos de cadena corta

La Tabla 6 muestra el efecto de la inclusión de GOD en la dieta sobre las concentraciones de AGCC en la digesta ileal. El tratamiento con E250 aumentó las concentraciones de ácido acético, ácido butírico y AGCC totales en comparación con otros grupos (p <0,05). Por otro lado, no se observan diferencias significativas entre los tratamientos con E500, E1000 y control. El suplemento de GOD en la dieta no tuvo efectos significativos sobre las concentraciones de ácido propiónico, ácido isovalérico y ácido valérico (p <0,10).

• Biodiversidad de la microbiota ileal

La secuenciación Illumine mostró un total de 794 875 lecturas bacterianas de alta calidad del ARNr 16S a partir de 24 muestras de ADN ileal. A continuación, las secuencias se agruparon en 2105 unidades taxonómicas operativas (OTU) con un límite seguridad de 97%. El diagrama de Venn mostró que 314 de las 2105 OTU se compartían entre distintos tratamientos, representando 96.51% de la riqueza de la microbiota ileal. En particular, las OTU 553, 27, 390 y 85 eran únicas para los grupos de control, E250, E500 y E1000, respectivamente (Figura S1). Los índices de diversidad alfa de cada grupo se presentan en la Tabla 7. Los tratamientos con E250 redujeron significativamente el número de especies observadas en comparación con los grupos de control y E500 (p <0,05). Los índices Chao y ACE fueron menores en el tratamiento con E250 que en los tratamientos control y E500 (p <0,05). Por otro lado, no se observaron diferencias significativas entre E1000 y los demás tratamientos (p <0,10). La suplementación de GOD en la dieta no tuvo efectos significativos sobre los índices de Simpson y Shannon (p <0,36).

La similitud entre las comunidades bacterianas presentes en cada uno de los grupos se representa mediante el análisis de coordenadas principales (PCoA) en la figura 1. En el gráfico, hecho en base en la distancia UniFrac no ponderada, el E250 modificó significativamente la estructura microbiana ileal (PERMANOVA; r = 0,18, p = 0,049); por otro lado, el E500 y el E1000 no la afectaron significativamente (p> 0,07) en comparación con el control (Figura 1, Tabla S2). La estructura de la microbiota ileal del grupo E500 divergió significativamente de la de los grupos E250 y E1000 (PERMANOVA; r= 0,17, p= 0,012 y r = 0,15, p= 0,043, respectivamente). Sin embargo, el gráfico PCoA, hecho en base al UniFrac ponderado mostró que se observó una diferencia significativa en la estructura de la microbiota ileal entre los tratamientos E250 y E500 (PERMANOVA; r= 0,28, p= 0,33) y no hubo diferencias significativas entre los grupos control y E250, control y E1000, y E500 y E1000 (Tabla S2). 

• Composición de la microbiota ileal

La figura 2 presenta la abundancia relativa de los principales filums y géneros (primeros 10). Los filums Firmicutes, Proteobacteria y Bacteroidetes representaron más del 98 % de todas las secuencias. El tratamiento con E250 aumentó significativamente la abundancia relativa de Firmicutes, pero disminuyó la de Proteobacteria, Acidobacteria, Sprichaetes, y Euryarchaeota a nivel de filum, en comparación con el grupo control (p < 0,05). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en la abundancia relativa de los filums Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria y Spirochaetes entre los grupos control, E500 y E1000 (p > 0,11). El filum Fusobacteria colonizó la digesta ileal de las aves tratadas con E500; sin embargo, esto no fue observado en los pollos de engorde sometidos a los otros tratamientos. A nivel de género, los géneros Lactobacillus, Escherichia-Shigella, Enterococcus y Cadidatus Arthromitus representaron el 87,1 – 97, 9 % de todas las secuencias. El tratamiento con E250 aumentó significativamente la abundancia relativa de Lactobacillus, pero redujo la abundancia del grupo Escherichia-Shigella, Candidatus Arthromitus, Ruminococcaceae UCG-002 y Lachnospiraceae NK4A136 en comparación con el grupo control (p < 0,05). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en la abundancia relativa de los géneros Lactobacillus, Escherichia-Shigella, Candidatus Arthromitus, Bacteroides, Ruminococcaceae UCG-002 y Lachnospiraceae NK4A136 entre los grupos control, E500 y E1000 (p <0,10). 

Discusión

La GOD cataliza el proceso de oxidación de la β-D-glucosa en ácido glucorónico utilizando oxígeno atómico como aceptor de electrones con la generación sincrónica de peróxido de hidrógeno, lo cual mejora el ambiente intestinal de los animales [3]. En este estudio, la suplementación con 250 U GOD/kg de dieta aumentó la GDPC en pollos de engorde durante el periodo de crecimiento (día 22 a 42). Asimismo, Zhao et al. descubrieron que la inclusión de 200 U/kg de GOD disminuía la TCA en los pollos de engorde de crecimiento lento en los días 42 al 77 [30]. Sin embargo, varios estudios reportaron que la dosis más baja de GOD (40-60 y 70 U GOD/kg de dieta, respectivamente) no tenía ningún efecto sobre el rendimiento en pollos de engorde de crecimiento rápido en los días 22 a 42 [7,31] y en los pollos de engorde de crecimiento lento entre los días 1 a 52 [8]. Las disparidades de estos resultados se atribuyen, al menos en parte, a las diferencias en las dosis de inclusión de GOD en la dieta y las líneas de pollos de engorde. Por el contrario, nuestros resultados mostraron que la inclusión de GOD no mejoró el rendimiento de los pollos de engorde en los días 1 a 21, lo que no concuerda con los hallazgos previos que indican que la inclusión de 40-60 U GOD/kg de dieta no mejoró la TCA de lo pollos de engorde en fase de inicio (día 1 a 21) [7,31]. Una explicación para esta discrepancia es que una dosis elevada de glucosa oxidasa sería capaz de oxidar demasiada glucosa [3], lo cual perjudicaría el desarrollo intestinal de los pollos de engorde [32]. Nuestros datos también revelaron que la dosis alta de GOD (mayor a 250 U/kg) no mejoró más el rendimiento de los pollos de engorde en los días 22 a 42. Es posible que la dieta con 250 U GOD/kg de dieta fuera capaz de satisfacer las necesidades de oxidación de la glucosa intestinal. 

Se midió la digestibilidad de los nutrientes y la morfología intestinal en el día 42 para explorar el mecanismo de mejora del rendimiento de los pollos de engorde en fase de crecimiento (día 22 a 42). Nuestros resultados mostraron que la inclusión de GOD en la dieta aumentaba las DIA de los aminoácidos, lo cual podría mejorar el rendimiento de los pollos de engorde. Asimismo, la inclusión de 60 u GOD/kg aumentó la digestibilidad aparente de Ca, P y PC en pollos de engorde al día 42 [7,31]. Nuestros resultados sobre los aumentos de la altura de las vellosidades yeyunales e ileales en pollos de engorde tratados con E250 indican que la dosis adecuada de inclusión de GOD mejoró la función de absorción intestinal en pollos de engorde. Así también, estudios previos hallaron que la inclusión de GOD en la dieta protege la integridad de la mucosa intestinal y la unión estrecha y que aumenta la absorción de nutrientes en el intestino de pollos de engorde [8,33]. El aumento de ácido butírico ileal y la disminución del pH de la digesta ileal que se han presentado aquí aumentarían el transporte de aminoácidos en el intestino de los animales [34, 35]. Asimismo, Wu et al. descubrieron que la disminución del pH en el contenido intestinal resultante de la inclusión de GOD activa las enzimas digestivas intestinales, como la pepsina y la quimotripsina, promueve la digestión y la absorción de nutrientes y mejora la tasa de metabolismo de lo nutrientes en pollos de engorde [7]. Además, la glucosa y algunos aminoácidos compartía los mismos transportadores [36-38]. Nuestro resultado sobre la disminución de glucosa intestinal resultante de la inclusión de GOD podría llevar al incremento de absorción de algunos aminoácidos en el intestino de pollos de engorde. 

La microbiota ileal es capaz de regular la morfología intestinal y la producción de AGCC procedentes de la fermentación de nutrientes no digeribles en el intestino posterior de los animales [14]. Nuestros resultados confirmaron que los filums más abundantes en el íleon del pollo son Firmicutes, Proteobacteria y Bacteroidetes [13] y el género más abundante es Lactobacillus, seguido dos géneros menores, Escherichia coli-Shigella y Enterococcus [39]. En el intestino humano,los miembros del grupo Firmicutes producen principalmente butirato, mientras que los Bacteroidetes producen principalmente propionato [40]. Así pues, el presente resultado sobre el aumento de la concentración ileal de butirato mediante la inclusión de GOD a una tasa de 250 U/kg de dieta podría deberse al aumento de la abundancia de Firmicutes. El Lactobacillus es la principal bacteria productora de ácido láctico [41]. Nuestro estudio descubrió que la dieta con 250 U/kg de GOD también aumentaba las concentraciones de ácido láctico y AGCC totales; lo cual, al menos en parte, podría atribuirse a la mayor abundancia del género Lactobacillus en la digesta ileal de pollos de engorde. Además, la microbiota ileal es uno de los principales componentes de defensa del intestino en pollos frente a las bacterias patógenas intestinales [15,16]. En este estudio, la suplementación con E250 en la dieta disminuyó la riqueza de la microbiota ileal de los pollos y fue evaluada mediante los índices Chao y ACE de microbiota. Nuestro resultado sobre la disminución del número de especies diferentes (OTU) también indicó que la inclusión de E250 en la dieta redujo la diversidad de la microbiota ileal de los pollos de engorde. Sin embargo, la suplementación con E250 en la dieta aumentó la abundancia relativa del género Lactobacillus. Estudios anteriores mostraron que el aumento de la abundancia de Lactobacillus, junto con el aumento de las concentraciones de ácido láctico y AGCC totales, podrían inhibir la replicación de algunos patógenos Gram negativos como Escherichia coli [42,43]. Nuestros datos sobre la disminución de la abundancia de Escherichia coli-Shigella resultante de la suplementación con E250 también respaldan esta idea. Además, las investigaciones previas han sugerido que el aumento de ácido butírico podría aumentar la superficie de absorción del intestino delgado al estimular la proliferación y diferenciación de las células epiteliales, lo cual a su vez conduciría a una mejor utilización de los nutrientes [31,44]. Los presentes resultados sobre la disminución del pH de la digesta ileal y el aumento de las concentraciones de ácido acético y ácido butírico indicaron que la inclusión de 250 U de GOD/kg mejora el entorno de equilibrio ácido-base intestinal, incrementando la absorción de nutrientes en el intestino delgado de los pollos de engorde. 

Los Candidatus Arthromitus se caracterizan por su adhesión al epitelio intestinal y su importante papel en la modulación de la función inmunitaria del huésped [45]. Estudios anteriores mostraron que la disminución de Candidatus Arthromitus se asociaba a un aumento de la concentración de IgA intestinal en la mucosa ileal del pollo [46-48]. Así pues, nuestros resultados referentes a la disminución de la abundancia de Candidatus Arthromitus acompañada del aumento de sIgA ileal sugieren que la inclusión de 250 mg/kg de GOD aumentaron la función inmunitaria ileal de los pollos de engorde frente a la infección por patógenos. Sin embargo, también descubrimos que las Fusobacterias aparecían en la digesta ileal de los pollos de engorde alimentados con la dieta tratada con E500, pero no en los otros grupos. El aumento de Fusobacteria, un comensal convertido en patógeno, está relacionado con una respuesta inflamatoria excesiva en el intestino de los animales [49]. Nuestro hallazgo sobre la presencia de Fusobacterias sólo en el grupo E500 indicó que la inclusión de E500 tendría el potencial de perjudicar la morfología y función intestinal de los pollos de engorde. También descubrimos que una dosis alta de GOD (E500 y E1000) no afectaba significativamente la estructura de la microbiota ileal en comparación con el grupo control, ni de manera similar al tratamiento con E250. Bedford y Apajalahti [50] descubrieron que la población de la microflora dependía de los sustratos fermentables, los cuales podrían ser desde compuestos poliméricos vegetales complejos como la celulosa, el xilano y las proteínas hasta los azúcares monoméricos más simples, los aminoácidos y los ácidos grasos. Nuestros datos sobre la ausencia de cambios en la DIA de aminoácidos totales entre los tratamientos con inclusión de GOD sugieren que las diferencias en la estructura de la microbiota ileal entre E250 y E500 o E1000 podrían no atribuirse a las diferencias en la digestibilidad de los aminoácidos. Wu et al. demostraron que la inclusión de GOD aumentaba la actividad de la amilasa ileal capaz de digerir el almidón en maltosa, monosacárido y glucosa [7]. Desafortunadamente, no determinamos la composición de la digesta ileal, particularmente la fibra, el almidón resistente y el monosacárido. Así pues, es necesario seguir investigando los efectos de la GOD sobre la digestibilidad de carbohidratos.

Conclusiones

La suplementación con 250 U de GOD/kg en la dieta aumentó la ganancia de peso corporal en pollos de engorde durante los días 22 a 42. La suplementación con 250-1000 U de GOD/kg de dieta aumento los DIA de arginina, isoleucina, lisina, metionina, treonina, cisteína, serina y tirosina en pollos de engorde (día 22 a 42). La suplementación con 250 U de GOD/ kg de dieta mejoró la morfología intestinal de los pollos de engorde y aumentó la función inmunitaria ileal y las concentraciones de AGCC en la digesta ileal; sin embargo, la inclusión de 500 a 1000 U de GOD/kg de dieta no afectó estos indicadores significativamente. Asimismo, la suplementación con 250 U de GOD/ kg de dieta disminuyó la riqueza de la microbiota ileal y alteró la estructura de la microbiota ileal en pollos de engorde, mientras que la inclusión de 500 o 1000 U de GOD/kg de dieta no alteró estos indicadores en comparación con el grupo control. 

Autores

Yong Meng 1,2,†, Haonan Huo 1,†, Yang Zhang 2, Shiping Bai 1,*, Ruisheng Wang 3, Keying Zhang 1, Xuemei Ding 1, Jianping Wang 1, Qiufeng Zeng 1, Huanwei Peng 1 and Yue Xuan 1

1 Feed Engineering Research Centre of Sichuan Province, Institute of Animal Nutrition, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; mengyong219@163.com (Y.M.); m18482109245@163.com (H.H.); zkeying@sicau.edu.cn (K.Z.); dingxuemei0306@163.com (X.D.); wangjianping@sicau.edu.cn (J.W.); zqf@sicau.edu.cn (Q.Z.); phw@sicau.edu.cn (H.P.); xuanyuede1007@hotmail.com (Y.X.)

2  Mianyang Habio Bioengineering Co. Ltd., Mianyang 610000, China; zhangy0523@126.com

3  Chongqing Academy of Animal Science, Chongqiang 402460, China; short00@163.com

*Correspondencia: shipingbai@sicau.edu.cn; Tel.: +86‐28‐86290922

† Estos autores contribuyeron a este trabajo de forma equitativa.